2016年度後期　第2回　細胞生物学セミナー　(唐原研)

日時：11月1日（火）17:00～　　場所：総合研究棟6階クリエーションルーム

Aequorin-based luminescence imaging reveals differential calcium signalling

responses to salt and reactive oxygen species in rice roots

Zhang, Y., Wang, Y., Taylor, L, J., Jiang, Z., Zhang, S., Mei, F., Wu, Y., Wu, P., Ni, J. (2015)

J of Exp Bot 66: 2535-2545

イクリオンに基づく発光イメージングはイネの根における塩分と活性酸素種（ROS）に対する

異なるカルシウム情報伝達応答を明らかにした。

　イネ（Oryza sativa L.）は塩分感受性作物とされ、塩分は生産性を制限する非生物的ストレスの1つである。植物の塩分応答経路にはSOS1,SOS2,SOS3からなる塩分過剰感受性（SOS）情報伝達経路が関与している。Ca²⁺は塩分ストレスを含む外部刺激に対して応答する植物の情報伝達経路のネットワークに必須な二次メッセンジャーであり、SOS情報伝達経路はCa²⁺流入によるCa²⁺スパイクにより活性化される。また、塩分ストレスはH₂O₂由来のROSの発生を増加させ、ROSがCa²⁺を増加するトリガーであることが判明している。本論文では、細胞集団や植物全体のCa²⁺測定に適している、Ca²⁺に特異的に反応するイクオリンプローブを含む遺伝子を遺伝子導入したイネ（‘Nipponbare’）を用いて、以下の実験を行った。

　遺伝子導入イネに外来性のCa²⁺処理を施したところ、根において発光シグナルが見られたが、シュートではほとんど観察されなかった。次にキャリブレーションにおいて残存するイクオリン量を見積もり、Ca²⁺濃度の較正に必要な放出溶液に含まれるエタノール濃度の検討を行った。シロイヌナズナでは10%エタノールが用いられるが、イネでは25%エタノールを含む放出溶液を使用することが望ましいことが示唆された。次にイネの根において0～2 M のNaCl処理を施すことで塩分ストレスの応答に対するCa²⁺の変化を調べた。その結果、Ca²⁺依存性発光シグナルの強度はNaCl濃度に依存しており、発光強度の急速な増加はNaCl濃度の狭い範囲（0.1～0.25 M）の範囲で起こっていた。次にROSストレスによるCa²⁺の変化を調べるために、0～5 mMのH₂O₂処理後のイクオリン発光を検討したところ、H₂O₂濃度はNaCl同様に濃度依存的に強い発光シグナルが見られた。発光シグナルは1,2分後に明瞭に観察されたが、それ以降は見られなかった。また、NaClとH₂O₂処理によるCa²⁺応答のタイムコースを調べたところ、異なる濃度のNaClで同じ継続時間と時期で即時型のCa²⁺スパイクが誘発されたのに対し、H₂O₂ではH₂O₂濃度に従ってCa²⁺スパイクの誘発のタイミングが遅延していた。さらにNaClおよびH₂O₂誘発性のCa²⁺応答のソースを調べるために4種類の阻害剤（GdCl₃，LaCl₃，ネオマイシン，タプシガルジン）を使用した。NaCl処理の応答で増加したCa²⁺は1 mMのGdCl₃，LaCl₃で完全に、ネオマイシン（InsP₃により誘発される内部貯蔵Ca²⁺放出の阻害）で50%、タプシガルジン（小胞体へのCa²⁺蓄積の阻害）で有意に抑制された。一方H₂O₂処理の場合ではGdCl₃，LaCl₃，ネオマイシンは同様の結果を示したが、タプシガルジンでは抑制されなかった。最後にNaClおよびH₂O₂誘発性の遺伝子発現におけるCa²⁺応答への寄与を調べるために、イネでNaClおよびH₂O₂誘発性の遺伝子として報告されているSERF1，MAPK5，DREB2A，SNAC1の発現量をqRT-PCR法で分析した。NaCl処理により、全ての遺伝子の発現レベルが増加し、LaCl₃で前処理すると発現が抑制された。この結果からこれらの遺伝子の誘導がCa²⁺依存的様式であることが示唆された。しかし、H₂O₂処理ではDREB2A以外の3つの遺伝子の発現レベルが増加し、LaCl₃前処理によりMAPK5の発現が抑制されたが、SER1とSNAC1の発現は抑制されなかった。つまり、SER1とSNAC1はCa²⁺非依存的様式であることを示唆している。以上のことから、NaClとH₂O₂によりCa²⁺が誘発される原因は異なっていることが明らかとなった。

興味を持たれた方はお気軽にご参加下さい。　　北平佑貴