2012年度後期　第5回　細胞生物学セミナー

日時：11月20日（火）17:00～

場所：総合研究棟6階クリエーションルーム

Adaptin-like protein TPLATE and clathrin recruitment during plant somatic cytokinesis occurs via

two distinct pathways

Van Damme, D., Gadeyne, A., Vanstraelen, M., Inzé, D., Van Montagu, M. C. E., De Jaeger, G.,

Russinova, E., Geelen, D. (2010)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (2) : 615–620

植物の細胞質分裂間のアダプチン様タンパク質TPLATEとクラスリンの利用は異なる２つの経路で起こる

高等植物における細胞質分裂は細胞板の形成により起こる。植物細胞が分裂期後期後半になると、細胞壁の主成分である多糖や糖タンパクを含むゴルジ体由来の小胞が分裂面に輸送され、そこで融合して初期細胞板が形成される。さらに小胞が融合すると細胞板は遠心的に成長していき、最後には親細胞の細胞壁と接続して細胞を2つに分割し細胞質分裂は完了する。ゴルジ体からの小胞輸送にはクラスリン被覆小胞によるクラスリン媒介エンドサイトーシスが主に使われることが知られており、クラスリン被覆小胞は小胞の積み荷分子とその受容体、アダプチン、3本の重鎖・軽鎖ポリペプチドからなるクラスリンにより構成される。しかし、植物における細胞板の成長および親細胞の細胞壁との接続における小胞輸送について知られていることは少ない。著者らが以前行った研究では、タバコ培養細胞BY-2（Nicotiana tabacum ‘Bright Yellow 2’）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の実生においてアダプチン様タンパク質TPLATEの活性を低下させたところ、細胞板が親細胞の細胞壁と正常に接続されなかったためTPLATEは細胞板の形成と何らかの関係があると考えられる。そこで本研究ではアダプチン様タンパク質TPLATEとクラスリンとの相互作用、それらの皮層分裂領域における細胞板の形成および親細胞の細胞壁への接続との関係性について調査した。

まず、TPLATEとクラスリン軽鎖2（CLC2）に蛍光タンパク質（GFP、mCHERRY）をそれぞれ結合し発現させたBY-2を、細胞膜を染色するFM4-64で染色し共焦点顕微鏡での観察および蛍光強度の測定を行った。その結果、TPLATEとクラスリン軽鎖は細胞板、細胞膜および皮層分裂領域（cortical division zone ; CDZ）において共に局在していたが、細胞板が親細胞壁と接続する部分では共に見られなかった。このことから細胞板が親細胞壁と接続する部分、皮層分裂位置（cortical division site ; CDS）ではTPLATEとクラスリン軽鎖は特異的に排除されることが示された。次に、2つに分割したGFPにTPLATEとクラスリン軽鎖と重鎖をそれぞれ結合させ、2つずつタバコの葉に導入してその蛍光をみるBiFC法により、これらのタンパク質が相互作用しているかを調査した。みられた蛍光から、クラスリン軽鎖は重鎖、TPLATEはクラスリン軽鎖と重鎖とそれぞれ相互作用しており、TPLATEはクラスリン媒介エンドサイトーシスとして働くことが示唆される。また、TPLATE と細胞質分裂との関連性を調べるため、阻害剤を用いた実験も行った。TPLATE-GFPとCLC2-GFPを発現させたBY-2に細胞質分裂を阻害するカフェインによる処理を行い、分裂期後期および初期細胞板形成時から細胞板形成が完了するまで観察したところ、TPLATEとクラスリン軽鎖は処理後すぐに細胞板から見られなくなっていたが、細胞板と親細胞壁の接続時に皮層分裂領域において局在が見られ、そこから細胞板に沿って求心性に局在が見られた。シロイヌナズナの根においても同様にTPLATE-GFPとCLC2-GFPを発現させ、カフェインによる処理を行い、FM4-64で染色し観察した。その結果、BY-2と同様にTPLATEとクラスリン軽鎖は初期細胞板形成時には細胞板から見られなくなっていたが、細胞板と親細胞壁の接続時に皮層分裂領域において局在が見られた。このことから、細胞質分裂時におけるTPLATEを含むクラスリン媒介エンドサイトーシスは、カフェイン感受性の初期細胞板形成時における細胞板形成に関わる経路およびカフェイン非感受性の細胞板と親細胞壁の接続時における細胞壁の接続に関わる経路の2つの異なる経路を持つ可能性が示唆される。さらに、皮層分裂領域における局在と細胞板の形成の関係を調べるため、小胞体からゴルジ体への輸送を不活性化したシロイヌナズナ変異体gnl1-1にゴルジ体を分解するブルフェルジンＡによる処理を行い、細胞板が形成されない状態で根におけるTPLATE-GFPの観察を行ったところ、皮層分裂領域における局在に変化は無かった。このことから、TPLATEの細胞壁の接続に関わる経路は小胞体からゴルジ体への輸送経路とは異なることが示唆される。

興味を持たれた方は、是非ご参加ください。　　栗林剛正