2013年度後期 第4回 細胞生物学セミナー
日時：11月12日(火) 17:00~
場所：総合研究棟6階クリエーションルーム
A mechanism for localized
lignin deposition in the endodermis
Lee, Y., Rubio, C.M., Alassimone, J.,
Geldner, N. (2013)
Cell, 153, 402–412
内皮における局在化したリグニン沈着の仕組み
細胞外マトリクスや細胞壁成分の局在化した沈着は多細胞生物の正しい発達と機能において重要である。リグニンは細胞壁に沈着し、様々な環境ストレスに対応して形成される細胞壁修飾の主な要素であり、アポプラストバリアを形作るカスパリー線の形成にも影響する。近年、リグニンの形成自体は木部分化のアポトーシス後に見られることが示された。しかし、リグニン自体の重合度は細胞によってどのように調節されているか、またどのような因子によってリグニン重合が局所的に開始または制限されているかは未だに不明である。本研究では、シロイヌナズナの各種変異体および阻害剤を用いてカスパリー線形成への影響と局在の様子を調べ、内皮中におけるリグニン沈着の仕組みを明らかにすることを目的とした。内皮バリアが損なわれる変異体を20,000のEMS処理株からスクリーニングし、得られた11のうち6の変異体は相補性を形成しており、その変異体は逆遺伝学的に得られていた、NADPH酸化酵素の遺伝子であるRespiratory burst
oxidase homolog F遺伝子（RBOHF）のT-DNA挿入による破壊株と一致していた。これらの変異体を”Schengen”と名付けた。ミスセンス変異であるSchengen遺伝子の変異体であるsgn4/rbohf変異体の5日齢個体においてヨウ化プロピジウム（PI）染色によってカスパリー線およびアポプラストバリアを可視化し、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行い、野生型（WT）と比較したところアポプラストバリア形成の強い遅れがあることが示された。RBOHFがカスパリー線形成と関連していると考えられたため、各実験を行った。先行研究において、カスパリー線ドメインタンパク質（CASPs）に関する変異体であるcasp1/casp3二重変異体を観察したところ、異常なパッチ状のカスパリー線様構造の形成が認められた。そこで野生型とrbohf変異体におけるpCASP1::CASP1-GFPの局在を観察したところ、網状のカスパリー線膜ドメイン（CSD）において正常に局在していた。従ってCASPの局在にRBOHFが必要ないことが示唆された。次にリグニン重合には過酸化水素（H2O2）の触媒によるモノリグナールの酸化が必要であり、そのH2O2生成にSGN4/RBOHFが必要であるという可能性を検証した。モノリグノール生合成阻害剤であるピペロニル酸（PA）を芽生えに与えて24時間生育させた後、外部からモノリグノールを与えると6時間でカスパリー線形成を誘導できるため、この系を用いると副作用の強いNADPH酸化酵素阻害剤であるジフェニレンヨードニウム（DPI）の処理時間を短くした上でカスパリー線形成における影響を見ることができる。モノリグノールと同時にDPIを加えてインキュベートしたところ、カスパリー線を形成しなかった。これより、内皮においてカスパリー線形成にはNADPH酸化酵素が必要であることが判明した。また、H2O2の局在を高電子密度の沈殿として検出することができる塩化セリウムで処理し電子顕微鏡下で観察を行った。非処理個体において観察できたカスパリー線におけるH2O2の局在がDPI処理個体ではほとんど見られず、NADPH酸化酵素がカスパリー線形成位置において局在または局所的に活性化していることが示唆された。実際に3種のRBOH（B, DまたはF）とmCherryとのコントラストのうちRBOHFのみがCSDに局在化することがわかった。次に、6日齢のPA処理個体に、スーパーオキシドのH2O2とO2への不均化に働く酵素であるスーパオキシドジスムターゼ（SOD）の阻害剤であるジエチルジチオカルバミン酸（DDC）、H2O2除去剤であるヨウ化カリウム（KI）、ペルオキシターゼ阻害剤であるサリチルヒドロキサム酸（SHAM）でそれぞれ処理を行ったところ、全てにおいてカスパリー線形成がブロックされたことから、カスパリー線形成に関わるリグニン重合にはSODによるスーパーオキシドからのH2O2生成およびペルオキシターゼ活性が必要となることが示唆された。また、内皮において強く発現するペルオキシターゼの一つであるPER64のノックダウン変異体におけるカスパリー線のバリア形成を観察した。その結果としてバリア形成に強い遅れが見られた。さらにCASP1-GFPバックグランドにおいてPER64-mCherryの局在を観察したところ、両者の共局在が確認され、PER64がCSDに局在化することが示された。
本実験では、CASPsの作用を通じたNADPH酸化酵素のCSDへの局在とSODによる反応によってH2O2の産生が局所的に生じ、同じくCSDに局在化するペルオキシターゼとH2O2の反応によりモノリグノナールが重合してリグニンが沈着する結果、植物においてアポプラストバリアとなるカスパリー線がCSDに正確に形成することが示唆された。
興味をもたれた方は是非ご参加下さい。松本 惇