2014年後期　第10回　細胞生物学セミナー（唐原研究室）

12月16日（火）16:30～　　　総合研究棟6階 クリエーションルーム

A receptor-like kinase mutant with absent endodermal diffusion barrier displays

selective nutrient homeostasis defects

Pfister, A., Barberon, M., Alassimone, J., Kalmbach, L., Lee, Y., Vermeer, EM. J., Yamazaki, M.,

Li, G., Maurel, C., Takano, J., Kamiya, T., Salt, E. D., Ropplo, D., Geldner, N. (2014)

eLife 2014;3:e03115. DOI: 10.7554/eLife.03115

内皮における拡散バリアを欠く受容体様キナーゼ変異体は選択的な無機養分の恒常性の欠損を示す。

　植物の根の内皮において、外部から取り込んだ水や溶質を木部へ選択的に輸送するためにはアポプラスト輸送を遮るカスパリー線が大きく関わる。カスパリー線は内皮細胞膜の一部に疎水性物質であるスベリンやリグニンが局所的に沈着して内皮細胞の細胞壁間を塞ぐことで形成される。カスパリー線が形成される部位はカスパリー線膜ドメイン（CSD）と呼ばれ、CSDにはリグニン重合に関わる酵素（Lee et al., 2013）、リグニン生合成の局所的な応答の足場となるカスパリー線ドメインタンパク質（CASPs）（Roppolo et al., 2011）、リグニンの局在を誘導するDirigentドメインを含むタンパク質ENHANCED SUBERIN1（ESB1）（Hosmani et al., 2013）などのカスパリー線形成に必要な要素の局在が確認されている。これらカスパリー線形成に関わる変異体を用いた研究では、カスパリー線のみならず細胞全体のスベリンラメラの沈着異常など他部位での表現型変異も生じるために、純粋にカスパリー線欠損の結果を把握することが困難であった。そこで本研究では、新たに発見されたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana ( L. ) Heynh Col-0）の根の内皮にて強く発現する受容体様キナーゼであるSCHENGEN3（SGN3）のノックアウト変異体（sgn3）を用いて内皮カスパリー線欠損が他のカスパリー線形成要素や選択的物質輸送に与える影響を調べた。

　sgn3は内皮バリア変異体のスクリーニングにて発見された（Lee et al., 2013）。sgn3では他の変異体では見られる、補償作用として現れるスベリン化の上方制御の異常などが見られない。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、13~14日齢のsgn3の根でアポプラストトレーサーであるヨウ化プロピジウム（PI）を用いたバリアの可視化の観察を行った。野生型と比較して、sgn3では明らかな拡散バリアの欠損が確認された。また、透徹後のリグニンの自家蛍光によるカスパリー線の局在、フルオロルイエロー染色によるスベリンラメラ局在を観察し比較したところ、カスパリー線自体の局在のみに異常が見られた。次にCASPsとSGN3との関係を調べるために、CASP1プロモーターにCASP1と緑色蛍光タンパク質（GFP）の融合遺伝子を導入した変異体（pCASP1::CASP1-GFP）を作製し、CASP1-GFP局在の経時観察を行った。CSDにおけるCASP1-GFP局在自体は両変異体にて観察されたが、sgn3では部分的なパッチ状の局在にとどまった。また、pSGN3の発現はpCASP1よりも早く開始したことよりSGN3はCASP1の局在を主導するものと思われた。カスパリー線形成途中においてCSDはパッチ状になるが、SGN3は各パッチを取り巻くように局在した。次にSGN3 とESB1の関係を調べるために、5日齢の野生型とsgn3の根においてESB1プロモーターにESB1と赤色蛍光タンパク質（mCherry）の融合遺伝子を導入した変異体（pESB1::ESB1-mCerry）を作製し、ESB1-mCherryの局在を観察した。局在は野生型において連続的であったが、sgn3ではCASP1-GFPと同様のパッチ状の局在となった。またsgn3とesb1との二重変異体（sgn3 esb1）、sgn3とcasp1 casp3との三重変異体（sgn3 casp1 casp3）を作製し、野生型と各変異体でのカスパリー線の自家蛍光とスベリン化の様子を比較した。sgn3 esb1とsgn3 casp1 casp3は他の変異体（sgn3, esb1, casp1 casp3）と比較してカスパリー線の形成領域が有意に減少しスベリン化領域は減少し回復した。これよりSGN3の働きはESB1やCASPsの制御の上流にあることがわかった。sgn3の環境条件に対する感受性を調べるために、sgn3変異体（sgn3-3, sgn3-4）を異なる温度条件（17℃, 21℃, 25℃）にて3週間生育した。生育後の生重量、蒸散量および根圧を測定した結果、野生型と比較してsgn3では有意な減少がみられた。また、SGN3とCASP1の機能を回復させた変異体（sgn3/pSGN3::SGN3-mVeus, sgn3/pCASP1::SGN3-GFP）では、生体重の回復がみられた。続いて野外で生育させた4週間齢個体のロゼット葉を誘導結合型プラズマ質量分析（ICP-MS）により元素含量分析を行った。野生型と比較して、sgn3ではカリウム（K）の有意な減少とマグネシウム（Mg）の有意な増加がみられた。また、sgn3の3週齢のロゼット葉ではK欠乏の症状である黄化が観察された。この症状は低K条件下で生育させると、より顕著となった。これはカスパリー線がカリウムに対する恒常性の維持に関わることを示唆している。

SGN3はカスパリー線形成に必要な要素の中でも主導的な役割を持ち、形成初期のパッチ状のカスパリー線をつなげることでカスパリー線形成を支える。また、カスパリー線は植物体内にて重要な元素の１つであるKの恒常性の維持に関わることが示された。今後、sgn3を用いることでカスパリー線と病原体耐性、ホルモン輸送、生長応答などとの関係が明らかとなっていくだろう。

興味をもたれた方は是非御参加下さい。　　　　　松本 惇