2015年度前期　第8回　細胞生物学セミナー　（唐原研）

日時：8月5日（水）10:00～　　場所：総合研究棟6階クリエーションルーム

MCA1 AND MCA2 THAT MEDIATE Ca²⁺ UPTAKE HAVE DISTINCT AND OVERLAPPING ROLES IN ARABIDOPSIS

Yamanaka, T., Nakagawa, Y., Mori, K., Nakano, M., Imamura, T., Kataoka, H., Terashima, A., Iida, K Kojima, I., Katagiri, T., Shinozaki, K., Iida, H（2010）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Plant Physiol. 152, 1284-1296　　

シロイヌナズナにおいてCa²⁺の取り込みを仲介するMCA1及びMCA2は別々の、かつ重複した役割をもつ

Ca²⁺は植物、動物の生長や発生にとって必須のイオンである。植物においては細胞壁の構造上の強剛性決定要因として、また細胞内の生理的要因に対して細胞外刺激の二次メッセンジャーとして必要とされている。しかしながらCa²⁺の分子的性質や、Ca²⁺透過性チャネルについて、また根においてCa²⁺の取り込みを行う輸送体の機能についてはまだ知られていない。先行研究においてシロイヌナズナにおけるCa²⁺透過性機械刺激受容性チャネル（MCA1）を同定した。またシロイヌナズナゲノムにおいてMCA1のパラログとしてMCA2が発見され、この2つのタンパク質は互いに同じ構造的特徴を共有している。本研究ではCa²⁺流入時期、植物生長、機械刺激受容性におけるMCA1及びMCA2の基本的な機能を、酵母（H207）及びシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）mca1-null、mca2-null単為変異体とmca1-null mca2-nullの二重変異体を用いて野生型と比較し検討した。

�@MCA1とMCA2の機能的類似性のテストを行うために、Saccharomyces cerevisiae mid1変異体の機能的相補性を利用した。この変異体はCa²⁺透過性機能刺激受容チャネルが欠損しているため接合フェロモンに晒されることで細胞死が起きる。またTDH3プロモーター下においてYEpTDHXho-MCA2として形質転換されている。定量分析によるとMCA2がMCA1と同様にこのmid1細胞内のCa²⁺の取り込み活性を補完し、接合フェロモンによる細胞死から部分的に保護していることが示唆された。�AMCA2とMCA1の発現パターンをGUS染色によって検証した結果、MCA2について播種から10日後の実生では葉肉細胞、維管束組織、中心柱、内皮、子葉、葉、ロゼット葉の中心でも発現が見られた。しかしMCA1は播種から10日後の実生まではMCA2と同じ発現パターンを示すが、22日後の実生においてMCA2ではロゼット葉の中心及び花序で、MCA1では頂端分裂組織や一次根の伸長域で強い発現レベルを示した。また根におけるMCA2発現の細胞内局在を調べるために、MCA2-GFP及びCaMV35プロモーターを使用して、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、MCA2-GFPが原形質膜に存在していることが分かった。これはMCA2が少なくとも二つの膜貫通節を持つことを示している。�BMCA2の植物体での機能解析を行うためにmca1 mca2-null二重変異体を作製し、この表現型の解析を行った。その結果二重変異体は単為変異体と比べロゼット葉の形成が遅れるといった明らかな生長障害を生じた。また35SプロモーターによるMCA2::GUS過剰発現条件においてはRT-PCR解析によってMCA1が抑制されることが示唆された。�Cシロイヌナズナの根において、MCA2によるCa²⁺取り込み活性を、⁴⁵Caを用いて測定した。野生型に比べmca2-null及びmca1 mca2-nullはそれぞれ46％、50％を下回る結果を示した。しかし先行研究においてmca1-nullにおいてそのような有意差は見られないとされる。したがって根におけるCa²⁺の取り込み活性はMCA2によるものであることが示唆された。�D二層寒天法を用いてmca1-nullとmca1 mca2-nullの表現型を観察したところ、mca2-nullの一次根は1.6%の寒天培地に侵入できたのに対し、mca1 mca2-nullの一次根はmca1-nullと同様に侵入できなかった。この結果から根における培地の硬度感知についての要因がMCA2ではなく、一次根におけるMCA1とMCA2の発現度の違いによるものである可能性が示唆された。�E一次根の発生段階における培地硬度及びCa²⁺の影響について様々な濃度のCa²⁺を含む0.8％または1.6％の培地を用いて単為変異体、二重変異体、野生型の根長を測定したところ、二重変異体だけが他に比べ短かった。またこの二重変異体だけがCa^2＋濃度よる変化が見られなかった。�FCa²⁺及びMg²⁺は互いに植物の原形質膜上における同じ透過部位を巡って競合するので、Mg²⁺が植物の生長にネガティブに影響した可能性がある。これを検証するために野生型及び各変異体を育成しているMS培地に30 mMのMg²⁺を加えて24日間育成した。すると二重変異体は特に重度の生長障害を引き起こしたが、10 mMのCaCl₂を加えると部分的に軽減した。この結果から生長障害の要因は過剰なMg²⁺によるものであると考えられる。また単為変異体の生長障害は野生型と似ていることから、高濃度のMg²⁺下でもMCA1、MCA2は十分に機能することが示唆された。これを踏まえ、二重変異体で観察されたMg²⁺による生長障害が、Mg²⁺によるCa²⁺抑制効果をもつ可能性があることをテストするために、MgSO₄の有無で分けられたMS培地で単為変異体、二重変異体及び野生型を育成した。MgSO₄ 30 mMが培地に含まれているとき、Ca²⁺の含有量は根やシュートでは著しく低下したがMg²⁺の含有量は著しく増加した。しかし野生型や各変異体間で有意差は見られなかった。10 mM のCaCl₂を加えた時も同様に野生型や各変異体間の有意差が見られなかった。この結果から二重変異体で観察されたMg²⁺による生長障害はCa²⁺による含有量の差からは説明できないことを示唆した。

興味をもたれた方は是非ご参加ください。　　森田 一輝